微生物限度檢驗方法驗證方案
◆適用范圍
本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。
◆目的
通過驗證確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定 。
◆職責
項目責任人:負責驗證方案的起草及具體實施。
驗證管理員:負責驗證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。
QA現(xiàn)場監(jiān)控員:負責驗證實施過程中的監(jiān)督檢查,取樣,確保結(jié)果的可靠性。
QC負責人:負責驗證方案中檢驗方法的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標準檢驗操作程序的準確執(zhí)行,負責組織實施。
QC檢驗員:負責驗證方案的起草與參與實施,并對所測數(shù)據(jù)準確性負責。
質(zhì)量部經(jīng)理:負責驗證方案及報告的審核和批準。
1.內(nèi)容
1.1.概述
通過驗證以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定;確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件,按制定的方法進行試驗,根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標準。若符合,按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查;若不符合,重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件,再進行驗證,直至驗證結(jié)果符合設(shè)立的驗證標準。
1.2.細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證
當建立藥品的微生物限度檢查時,應進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證,以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。
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1.2.1.驗證用菌株及菌種要求
大腸埃希菌【CMCC(B)44102】
金黃色葡萄球菌【CMCC(B)26003】
枯草芽孢桿菌【CMCC(B)63501】
黑曲霉【CMCC(F)98003】
白色念珠菌【CMCC(F)98001】
大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌,前述菌株作為細菌計數(shù)驗證用菌株;黑曲霉為霉菌,白色念珠菌為酵母菌,作為霉菌及酵母菌計數(shù)驗證用菌株。
驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 (從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代),并采用適宜的菌種保藏技術(shù),以保證試驗菌株的生物學特性。
1.2.2.驗證菌菌液制備
1.2.2.1. 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備:接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,35~37℃ 培養(yǎng)18~24小時。取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-6~10-7,制成每1ml含菌數(shù) 50~100cfu的菌懸液。
1.2.2.2.白色念珠菌菌液制備:接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中,23~28℃培養(yǎng) 24~48小時;取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-6~10-7,制成每1ml含菌數(shù) 50~100cfu的菌懸液。
1.2.2.3.接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,23~28℃培養(yǎng)5~7天,加入3~5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫,吸至無菌試管內(nèi),取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-4~10-6,制成每1ml含孢子數(shù)50~100cfu的孢子懸液。
1.2.3. 供試液的制備
1.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備
◆稀釋劑:pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
◆液體供試品:供試品10ml置錐形瓶中,加入90ml稀釋劑,混勻,作為供試液(1:10)。
◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品:稱取供試品10g置錐形瓶中,加稀釋劑至100ml,混勻后,作為供試液(1:10)。
1.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的制備
當供試品具有抑菌活性時,須先消除抑菌活性,其方法如下:
◆ 培養(yǎng)基稀釋法:取供試液2ml,每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿;或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿,傾注15ml的培養(yǎng)基,測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù),混勻,凝固,培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計算每1ml供試液的平均菌落數(shù), 按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù);控制菌檢查時可加大增菌液的用量。
◆離心沉淀集菌法:取一定量的供試液,3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘(供試液如有沉淀,先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,取全部上清液再離心),棄去上清液,留底部集菌液約2ml,加稀釋液補至原量。
◆薄膜過濾法:取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液,過濾,沖洗,按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。
◆ 中和法:選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當?shù)膶Π被郊姿幔亟饘俚乃幬镌谂囵B(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸,洗必泰制劑加入聚山梨酸 80(3%)或卵磷脂(3%),鹵素中加入硫代硫酸鈉(0.1%)等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。
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1.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。采用平皿法,取試驗用的1ml菌液(約50~100cfu)分別注入平皿中,立即傾入培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.試驗組
1.2.5.1.平皿法:取試驗可能用的稀釋級1ml供試液和50~100cfu試驗菌,分別注入平皿中,立即傾入培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.2.培養(yǎng)基稀釋法(平皿法):取試驗可能用的稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中,每個平皿再注入50~100cfu試驗菌,分別注入平皿中,立即傾入培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.3薄膜過濾法:取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液,過濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加入50~100cfu試驗菌,過濾,按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。
1.2.5.4. 離心沉淀集菌法:取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液,如供試液含許多藥渣,先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘,取全部上清液,再以3000轉(zhuǎn)/分離心 20分鐘,取下面1ml液體,并用稀釋劑洗滌管底,將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。
1.2.6. 供試品對照組
取規(guī)定量供試液,按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)(方法和試驗組相同)。
1.2.7.稀釋劑對照組
若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時,應增加稀釋劑對照組,用稀釋劑代替供試品,加入試驗菌,使最終濃度為每1ml 供試液含50~100cfu,按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。
1.2.8.回收率計算
1.2.8.1.試驗組回收率計算
試驗組的菌回收率= 試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數(shù) ×100%
菌液組的平均菌落數(shù)
1.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算
試驗組的菌回收率= 稀釋劑對照組平均菌落數(shù) ×100%
菌液組的平均菌落數(shù)
計數(shù)方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗,并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
1.2.8.3. 結(jié)果判斷
在3次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)≥70%。若試驗組的菌回收率(試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)≥70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù);若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%,應采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證,使試驗組菌回收率大于70%。
1.3. 控制菌檢驗方法驗證
當建立藥品的微生物限度檢查時,應進行控制菌檢查方法的驗證,以確認所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時,檢驗方法應進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。
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1.3.1.驗證用菌株
大腸埃希菌(Esherichia coli)【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus)【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)【CMCC(B) 50094】、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)【CMCC (B) 10104】
驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 (從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代),并采用適宜的菌種保藏技術(shù),以保證試驗菌株的生物學特性。
1.3.2.菌液制備
大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35~37℃培養(yǎng)18~24小時;分別取培養(yǎng)液 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-5~10-7,制成每1ml含菌數(shù)10~100cfu的菌懸液。
1.3.3. 陰性菌對照組 設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組,驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌;驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。
1.3.4.試驗組
1.3.4.1.常規(guī)法
◆ 大腸埃希菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,陽性菌對照加入大腸埃希菌10~100cfu,陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10~100cfu,35~37℃培養(yǎng)18~24小時,取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。
◆大腸菌群 取含適量(不少于10ml)的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支,分別加入含供試品1g或1ml 、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液,陽性菌對照加入大腸埃希菌10~100cfu,陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10~100cfu,35~37℃培養(yǎng)18~24小時,按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規(guī)定檢查。
◆沙門菌 取供試品10g或10ml,直接或處理后接種至適量(不少于200ml)的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,用勻漿儀或其他適宜方法混勻,陽性菌對照加入沙門菌 10~100cfu,陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10~100cfu,35~37℃培養(yǎng)18~24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。
◆銅綠假單胞菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10~100cfu,陰性菌對照加入大腸埃希菌10~100cfu,35~37℃培養(yǎng)18~24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。
◆ 金黃色葡萄球菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10~100cfu,陰性菌對照加入大腸埃希菌 10~100cfu,35~37℃培養(yǎng)18~24小時。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。
1.3.4.2. 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用,放大培養(yǎng)基量,由1:100放大到1:300、1:500或1:1000,由于容器體積限制,一般放大到500ml或1000ml,本法適用于抑菌作用不強的樣品。
1.3.4.3. 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時,取規(guī)定量供試液,過濾,沖洗,試驗菌應加在最后一次沖洗液中,過濾后,注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。
1.3.4.4. 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液,如供試液含許多藥渣,先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘,取全部上清液,再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘,取下面1ml液體,并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中,培養(yǎng),本法適用于中度抑菌作用的樣品。
1.3.4.5.中和法 在供試品溶液中加入相應的中和劑,以減除供試品中抑菌成分的作用,中和劑應對微生物無毒性,與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應對微生物亦無毒性,或有毒性但不影響待檢菌的檢出。
1.3.5.結(jié)果判斷
至少應進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌,照該供試液制備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查;若試驗組未檢出試驗菌,應采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。
2.驗證的實施
2.1細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。
2.2.分析數(shù)據(jù),綜合整個驗證過程,得出驗證結(jié)論。
2.3.驗證過程中發(fā)生的異常情況,按照《偏差處理程序》進行處理。
3.相關(guān)文件
《微生物限度檢查SOP》
4.再驗證
4.1.藥品的組分發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時。
4.2.驗證時檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時。